Вирус гепатита С: вирусология и жизненный цикл

Аннотация Вирус гепатита С (ВГС) представляет собой одноцепочечный РНК-вирус позитивного смысла в...
Геном ВГС и его продукты
Структурные белки
Неструктурные белки
HCV вирион и липовирочастица
Вирусная привязанность, проникновение и слияние
Рецептор мусорщика класса B тип I
CD81
Белки плотного соединения Claudin 1 и Occludin
Рецептор тирозинкиназ и Ниманна-Пика C1-подобный 1-адсорбирующий холестерин рецептор
Трансляция РНК HCV, процессинг и репликация полипротеина
Вирусная сборка и выпуск
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Сокращения
Рекомендации
Таблица 1.

Аннотация
Вирус гепатита С (ВГС) представляет собой одноцепочечный РНК-вирус позитивного смысла в семействе Flaviviridae . Это вызывает острый гепатит с высокой склонностью к хронической инфекции. Хроническая инфекция HCV может прогрессировать до тяжелого заболевания печени, включая цирроз и гепатоцеллюлярный рак. За последнее десятилетие наше базовое понимание вирусологии и жизненного цикла ВГС значительно улучшилось с развитием систем культивирования и репликации клеток ВГС. Наша способность лечить HCV-инфекцию также была улучшена благодаря комбинированному применению интерферона, рибавирина и низкомолекулярных ингибиторов протеазы NS3 / 4A, кодируемой вирусом, хотя необходимы лучшие терапевтические возможности с большей противовирусной эффективностью и меньшей токсичностью. В этой статье мы рассмотрим различные аспекты жизненного цикла HCV, включая прикрепление вируса, проникновение, слияние, трансляцию вирусной РНК, посттрансляционный процессинг, репликацию HCV, сборку и высвобождение вируса. Каждый из этих шагов обеспечивает потенциальные цели для новых противовирусных терапевтических средств для лечения инфекции HCV и предотвращения неблагоприятных последствий прогрессирующего заболевания печени.

ВСТУПЛЕНИЕ

Вирус гепатита С (HCV) - это гепатотропный РНК-вирус рода Hepacivirus семейства Flaviviridae , первоначально клонированный в 1989 году как возбудитель гепатита не-А, не-В. 1 , 2 Это вызывает острый и хронический гепатит у людей и шимпанзе с высокой склонностью к хроническому. При отсутствии лечения хронический гепатит С может прогрессировать в цирроз и гепатоцеллюлярную карциному у некоторых пациентов. 3 До недавнего времени стандарт оказания медицинской помощи пациентам с хроническим гепатитом С включал двойную терапию пегилированным интерфероном (ИФН) альфа и рибавирином (ПЭГ ИФН / риба) в большинстве стран. Двойная PEG IFN / терапия риба достигла устойчивого вирусологического ответа (SVR) только у 50% пациентов, инфицированных более распространенным генотипом HCV (генотип 1) по сравнению с 80% частотой SVR у пациентов, инфицированных генотипом HCV 2 или 3. 4 Кроме того, комбинированная терапия PEG IFN / риба является дорогостоящей и длительной (например, 24-48 недель) с многочисленными побочными эффектами, которые трудно переносить. В 2011 году два ингибитора кодируемой вирусом протеазы NS3 / 4A стали доступны в качестве части стандартной терапии в некоторых странах, особенно против генотипа 1 HCV. Тройная терапия, сочетающая один из этих ингибиторов протеазы первого поколения с терапией PEG IFN / riba, улучшила Частота SVR от 50% до 70% в некоторых группах клинических исследований, 5 - 8 Однако эта новая схема имеет ограниченную эффективность в определенных особых группах населения (например, у пациентов с циррозом, у реципиентов трансплантата, у первичных пациентов, не отвечающих на лечение, и у пациентов, находящихся на гемодиализе), из-за лежащей в основе резистентности к IFN, появления мутаций устойчивости к ингибитору протеазы и / или повышенной токсичности лекарственного средства. Таким образом, предпринимаются усилия в направлении улучшения терапевтических вариантов с более короткой продолжительностью лечения при меньшей токсичности и лекарственной устойчивости, предпочтительно в виде не содержащих IFN, всех пероральных комбинаций. Недавние разработки в области лечения гепатита С были значительно улучшены благодаря базовому пониманию вирусологии и жизненного цикла вируса гепатита С, благодаря исследованиям с использованием систем культивирования клеток гепатита С и анализа репликации. В этой статье мы рассмотрим различные этапы жизненного цикла HCV, которые также служат релевантными мишенями для потенциальных новых терапевтических средств, включая прикрепление вируса, проникновение, слияние, трансляцию вирусной РНК, посттрансляционную обработку, репликацию HCV, сборку и высвобождение вируса ( рисунок 1 ). 9

Геном ВГС и его продукты

ВГС - это одноцепочечный РНК-вирус с положительным смыслом, длиной примерно 9600 нуклеотидов. Приблизительно 1012 вирусных частиц генерируется ежедневно у хронически зараженного ВГС пациента. 10 Из-за склонной к ошибкам РНК-полимеразы HCV также демонстрирует замечательное генетическое разнообразие и склонность к выбору мутаций уклонения от иммунитета или лекарственной устойчивости. 11 Существует 6 основных генотипов HCV (пронумерованных 1-6), которые отличаются друг от друга по нуклеотидной последовательности более чем на 30%. 12 Геном HCV имеет одну сплошную открытую рамку считывания, фланкированную нетранслируемыми областями (NTR) на 5 'и 3' концах. 5'NTR HCV содержит 341 нуклеотид, расположенный выше кодирующей области, и состоит из 4 доменов (пронумерованных от I до IV) с высокоструктурированными элементами РНК, включая многочисленные стволовые петли и псевдоузел. 13 , 14 5 'NTR также содержит внутренний сайт входа рибосомы (IRES), который инициирует независимую от шапки трансляцию генома HCV в один полипротеин 15 путем набора как вирусных, так и клеточных белков, таких как факторы эукариотической инициации (eIF) 2 и 3. 16 - 18 Открытая рамка считывания HCV содержит от 9024 до 9111 нуклеотидов в зависимости от генотипа. Он кодирует один полипротеин, который расщепляется хозяином и вирусными протеазами в 10 отдельных вирусных белков с различными характеристиками. 19

Структурные белки

Ядро HCV представляет собой вирусный нуклеокапсидный белок с многочисленными функциональными возможностями, включающими связывание РНК, иммунную модуляцию, передачу сигналов клетки, онкогенный потенциал и аутофагию. Основной белок HCV также ассоциируется с липидными каплями, где также происходит сборка HCV. HCV E1 / E2 представляют собой гликозилированные гликопротеины оболочки, которые окружают вирусные частицы. Оболочка HCV нацелена на вирус-нейтрализующее давление отбора антител с высокой степенью вариабельности последовательности, которая может сделать ответы антител неэффективными и способствует персистенции HCV. 20 - 22 Белок малого ионного канала p7 находится ниже области оболочки и необходим для сборки и высвобождения вируса.

Неструктурные белки

NS2 является вирусной аутопротеазой, которая играет ключевую роль в сборке вируса, опосредуя расщепление между NS2 и NS3. NS3 кодирует N-концевую сериновую протеазу HCV и C-концевую РНК-геликазу-NTPase. Протеаза NS3 играет критическую роль в процессинге HCV путем расщепления нисходящего потока NS3 на 4 сайтах (между NS3 / 4A, NS4A / 4B, NS4B / NS5A, NS5A / NS5B). Он также расщепляет адаптерный белок TLR3 TRIF и митохондриальный противовирусный сигнальный белок MAVS, блокируя тем самым клеточный путь индукции IFN I типа. 23 NS3 является одной из ключевых задач для разработки противовирусных препаратов против ВГС. NS4A образует стабильный комплекс с NS3 и является кофактором протеазы NS3. Роль NS4B не совсем понятна, хотя известно, что он вызывает образование мембранной ткани. NS5A представляет собой димерный цинк-связывающий металлопротеин, который связывает вирусную РНК и различные факторы-хозяева в непосредственной близости от ядра ВГС и липидных капель. Ингибиторы HCV NS5A показали противовирусный эффект у пациентов и находятся в стадии быстрого клинического развития. Наконец, NS5B является РНК-зависимой РНК-полимеразой (RdRp), которая также активно направлена на разработку противовирусных препаратов.

В совокупности эти белки также вносят вклад в различные аспекты жизненного цикла HCV, включая прикрепление вируса, проникновение и слияние, трансляцию РНК HCV, посттрансляционный процессинг, репликацию HCV, сборку и высвобождение вируса.

HCV вирион и липовирочастица

Вирусная частица HCV включает в себя геном РНК HCV, ядро и оболочку гликопротеинов, E1 и E2. 2 Геном РНК HCV взаимодействует с основным белком, образуя вирусный нуклеокапсид, в сочетании с цитозольными липидными каплями (cLD). Вирусный нуклеокапсид заключен в богатую липидами вирусную оболочку с гликопротеинами E1 и E2, которые играют ключевую роль в проникновении вируса посредством связывания и слияния рецепторов. 24 , 25 Гликопротеины E1 / E2 представляют собой трансмембранные гликопротеины типа I, которые могут образовывать нековалентные гетеродимеры в инфицированных клетках или крупные ковалентно связанные комплексы на вирусной частице. Они включают большой N-концевой эктодомен и короткий C-концевой трансмембранный домен. Трансмембранные домены участвуют в закреплении мембран, локализации эндоплазматического ретикулума (ER) и гетеродимеризации гликопротеинов оболочки. 26 - 28 Е1 и Е2 сильно гликозилированы, содержат до 6 и 11 сайтов гликозилирования, соответственно. 29 Гипервариабельные области были идентифицированы в гликопротеине оболочки E2. 30 В частности, гипервариабельная область 1 (HVR1) представляет собой длинный сегмент из 27 основных аминокислотных остатков с высокой степенью вариабельности последовательности, а также с высокой консервативной конформацией, что указывает на роль эпитопа, нейтрализующего HCV, и участия в факторе входа хозяина. 31 - 33 Вирион HCV также ассоциируется с различными липопротеинами, такими как apoE, apoB, apoC1, apoC2 и apoC3, образуя сложную липовирусную частицу (LVP), и различные липопротеиновые компоненты могут влиять на проникновение HCV. 34

Вирусная привязанность, проникновение и слияние

Вирусное проникновение в клетку-хозяина включает в себя сложную серию взаимодействий, включая прикрепление, проникновение и слияние. Первоначальное прикрепление вируса к его рецептору / корецепторам может включать HVR1 в HCV E2 35 , 36 с участием гепарансульфатных протеогликанов, экспрессирующихся на поверхности гепатоцитов. 37 - 40 В то время как рецепторы ЛПНП (ЛПНП) могут связывать ВГС и способствовать его проникновению в клетку, 41 Взаимодействие HCV-LDLR может быть непродуктивным и потенциально может привести к деградации вирусных частиц. 40 После прикрепления к факторам входа HCV интернализуется в клетки-мишени посредством pH-зависимого и клатрин-опосредованного эндоцитоза. 42 - 45 Были идентифицированы множественные клеточные рецепторы и факторы проникновения для ВГС, включая рецептор акцептора класса B типа I (SRB1), 46 и CD81 47 а также белки с плотным соединением, клаудин-1 (CLDN1) 48 и окклюдин (OCLN). 49 , 50 Дополнительные недавно идентифицированные факторы входа включают рецептор тирозинкиназы (RTK), рецептор эпидермального фактора роста (EGFR), рецептор эфрина A2 (EphA2) 51 и Niemann-Pick C1-like 1 рецептор абсорбции холестерина (NPC1L1). 52 Различные факторы входа кратко описаны ниже:

Рецептор мусорщика класса B тип I

Первые два фактора проникновения ВГС (SRB1 и CD81) были определены как партнеры связывания В2 ВГС. 46 , 47 SRB1 представляет собой мультилигандный гликопротеиновый рецептор из 509 аминокислот, который, как известно, является основным рецептором для липопротеинов высокой плотности (ЛПВП). 53 Он высоко экспрессируется в печени и способствует селективному поглощению сложных эфиров холестерина ЛПВП в гепатоцитах. 54 Роль SRB1 в проникновении HCV впервые была подтверждена его связыванием с E2 HCV через HVR1. 46 Активность переноса липидов SRB1 может потребоваться для проникновения в клетки HCV, поскольку липопротеиновые лиганды могут модулировать взаимодействия HCV / SRB1 с усилением проникновения HCV посредством HDL и ингибированием окисленными LDL. 54 - 57 Интересно, что уровень SRB1 на гепатоцитах может регулировать уровень проникновения HCV и инфекционности, 58 в то время как стероиды, такие как преднизолон, могут способствовать проникновению ВГС путем активации экспрессии SRB1. 59 Было показано, что человеческое моноклональное антитело против SRB1 предотвращает заражение HCV in vitro в гепатоцитах и in vivo с использованием химерных мышей, которым трансплантированы гепатоциты человека. 57 В фазе I клинического испытания пациентов, инфицированных ВГС, было показано, что антагонист SRB1 ингибирует репликацию ВГС с дополнительным синергизмом для других противовирусных препаратов. 60

CD81

Человеческий CD81 представляет собой молекулу тетраспанина, которая широко экспрессируется и участвует во многих клеточных функциях, включая адгезию, морфологию, пролиферацию и дифференцировку. Он включает 4 трансмембранных домена, 2 коротких внутриклеточных домена и два домена внеклеточной петли (маленький и большой). 54 CD81, вероятно, участвует после очень ранней фазы проникновения HCV (то есть после SRB1), способствуя конформационному изменению гликопротеина оболочки E1 / E2 HCV, чтобы способствовать низкому рН-зависимому слиянию и вирусному эндоцитозу. 61 Вовлечение на более позднем этапе после интернализации вируса также было предложено недавно. 62 Большая внеклеточная петля CD81 связывает HCV через гликопротеин E2 оболочки. 47 , 63 Последовательность большой внеклеточной петли CD81 сохраняется между людьми и шимпанзе, единственными 2 видами, которые допускают инфицирование HCV in vivo. 64 , 65 Однако CD81 из других видов (например, африканская зеленая обезьяна, тамарин, крысы, мыши, хомяк) может поддерживать проникновение клонов HCV in vitro, что позволяет предположить, что полиморфизм CD81 недостаточен для определения восприимчивости к HCV. 66 Хотя повсеместная экспрессия CD81 во множественных типах клеток может ограничивать сфокусированное терапевтическое применение, было показано, что анти-CD81 ингибирует проникновение HCV in vivo на модели репликации HCV у химерных мышей. 67

Белки плотного соединения Claudin 1 и Occludin

Было показано, что два белка с плотным соединением (CLDN1 и OCLN), выявленные путем скрининга библиотеки кДНК на клеточные факторы, которые делают возможным инфицирование псевдочастицами HCV, являются важными факторами входа для HCV. 48 , 50 Интересно, что ни CLDN1, ни OCLN не взаимодействуют напрямую с частицами HCV. Однако CLDN1 может взаимодействовать с CD81 как часть рецепторного комплекса HCV, 68 , 69 Считается, что CLDN1 и OCLN участвуют в более поздней фазе проникновения HCV, после SRB1 и CD81, хотя их точные роли не определены полностью. Было также показано, что гликопротеины оболочки HCV способствуют коэндоцитозу CD81 и CLDN1 в клатрин- и динамин-зависимом процессе. 62 Наконец, было показано, что моноклональные антитела против CLDN1 ингибируют инфекцию HCV в гепатоцитах in vitro путем нейтрализации взаимодействия между E2 HCV и CLDN1. 70 , 71

Рецептор тирозинкиназ и Ниманна-Пика C1-подобный 1-адсорбирующий холестерин рецептор

Два RTK, включая EGFR и EphA2, были недавно идентифицированы как факторы проникновения HCV с помощью функционального скрининга РНКи киназы. 51 Эти RTKs, по-видимому, участвуют в проникновении HCV после начальной стадии прикрепления / связывания, регулируя взаимодействия корецептора CD81 и CLDN1 и слияние мембран. RTK также способствовали клеточной передаче HCV. Важное для клинического применения, заражение всеми основными генотипами HCV и вариантами побега может быть ингибировано RTK-специфическими лигандами и антителами, включая эрлотиниб (EGFR-специфическое антитело, одобренное FDA для лечения рака). Наконец, группа в Чикаго определила NPC1L1 (чувствительный к холестерину рецептор, экспрессируемый на апикальной поверхности гепатоцитов, а также энтероцитов) в качестве нового фактора проникновения HCV, который может быть ингибирован доступным антагонистом NPC1L1 эзетимибом, который одобрен FDA для лечения гиперхолестеринемии. 52

В совокупности эти рецепторы и факторы проникновения обеспечивают потенциальные возможности для предотвращения заражения и распространения ВГС, при условии, что изменение их физиологической роли не приводит к значительной токсичности.

Трансляция РНК HCV, процессинг и репликация полипротеина

После проникновения клетки-мишени через рецептор-опосредованный эндоцитоз частица ВГС подвергается рН-зависимому слиянию мембран в кислотном эндосомальном компартменте, чтобы высвободить свой РНК-геном в цитоплазму. 19 , 44 , 45 Полипротеин HCV транслируется в грубой ER с РНК HCV с положительной цепью в качестве матрицы, с трансляцией, инициированной независимым от кепки способом через IRES в 5'NTR. Трансляция HCV дает один предшественник полипротеина длиной приблизительно 3000 аминокислот, который затем обрабатывается клеточными (например, сигнальными пептидазами) и вирусными протеазами (NS2, NS3 / 4A) для генерации 10 отдельных вирусных белков, включая гликопротеины ядра и оболочки, E1 и E2, p7, NS2, NS3, NS4A, NS4B, NS5A и NS5B, как указано выше. В процессе процессинга полипротеина белки HCV, по-видимому, связаны с «мембранной сеткой», которая включает в себя двухмембранные пузырьки, содержащие неструктурные белки HCV, РНК HCV, ER-мембраны и липидные капли. 19 , 72 , 73 Мембранная сеть в клетках, экспрессирующих HCV, по-видимому, индуцируется NS4B HCV, возможно, в комбинации с NS5A. 74 , 75 Считается, что в этих тканях происходит репликация вирусной РНК с использованием РНК-генома с положительной цепью в качестве матрицы для NS5B RdRp для генерации репликативного промежуточного звена с отрицательной цепью для получения дополнительных положительных смысловых геномов. Геномы зарождающейся положительной цепи РНК могут в дальнейшем транслироваться для получения новых вирусных белков, или служить в качестве матриц для дальнейшей репликации РНК, или собираться в инфекционные вирионы. В репликации HCV участвуют различные клеточные факторы, включая циклофилин A и фосфатидилинозитол-4-киназу IIIα (PI4KIIIα). Циклофилин А может модулировать РНК-связывающую способность полимеразы NS5B и взаимодействовать с NS5A. Как таковые, ингибиторы циклофилина оказывают противовирусное действие против HCV с продолжающейся клинической разработкой. 76 - 80 Что касается PI4KIIIα, то это липидкиназа, которая рекрутируется в мембранную сеть NS5A, необходима для репликации HCV и обеспечивает целостность мембранного репликационного вирусного комплекса. 81 - 84

Вирусная сборка и выпуск

Процесс сборки и выпуска HCV до конца не изучен. Тем не менее, похоже, что он тесно связан с метаболизмом липидов. 85 Связь между HCV и метаболизмом липидов впервые была отмечена в клинической практике на основе жировых изменений в ткани печени, которые, как было дополнительно показано, связаны с ядром HCV. 86 HCV-инфекция вызывает глубокие изменения внутриклеточного распределения липидных капель (LDs) 87 от генерализованной цитоплазматической картины в неинфицированных клетках до накопления вокруг перинуклеарной области в HCV-инфицированных клетках, связанных с вирусными белками и геномом. 88 , 89 Ассоциация ядра HCV с LDs, по-видимому, имеет решающее значение при сборке вируса, и вмешательства, которые блокируют это взаимодействие, нарушают производство вируса. 90 - 92 Вероятно, что все другие вирусные белки играют ключевую роль в процессе сборки, сосредоточившись вокруг липидных капель, где сборка запускается в мембранной и богатой липидами среде структурными белками HCV (core / E1 / E2 / p7 / NS2) и комплекс репликации. Путь секреции липопротеинов очень низкой плотности (ЛПОНП) тесно связан с таковым у собранных вирионов. 93 , 94 Вирион представляет собой липовирусную частицу с липидной композицией, которая напоминает ЛПОНП и ЛПНП с ассоциированным апоЕ и / или апоВ, которые необходимы для сборки инфекционного вируса. 93 - 96 Клинически значимые гистологические жировые изменения в печени связаны с клиническими и терапевтическими исходами. 97 и было показано, что генотип 3 ВГС опосредует больший стеатоз, 98 хотя его патогенетические механизмы, связанные с жизненным циклом ВГС, не ясны. Также следует отметить, что репликация HCV может контролироваться путем биосинтеза холестерина, а гиполипидемические препараты могут подавлять репликацию HCV in vitro. 99 , 100

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Со времени его первоначального клонирования ВГС мы получили значительные знания о жизненном цикле ВГС, включая проникновение, трансляцию, репликацию и взаимодействия с клетками хозяина ( Таблица 1 ). 101 Эти достижения также имеют решающее значение в разработке противовирусных препаратов для пациентов с хроническим гепатитом С. Через многие годы мы близки к тому, чтобы излечивать наших пациентов с помощью мощного, пангенотипического, экономически эффективного и менее токсичного терапевтического режима для предотвращения их прогрессирование до цирроза и рака печени. К числу оставшихся проблем относятся разработка профилактической вакцины для применения во всем мире (включая страны, не имеющие достаточного экономического развития или не имеющие доступа к недавно разработанным противовирусным препаратам) и лучшее понимание механизмов устойчивости и патогенеза этого захватывающего вируса.

Сокращения

CLD

цитозольные липидные капли

EGFR

рецептор эпидермального фактора роста

ЕИФ

эукариотический фактор инициации

HDLs

липопротеины высокой плотности

HVR1

гипервариабельная область 1

IRES

внутренний сайт входа рибосомы

LDLR

рецептор липопротеинов низкой плотности

NPC1L1

Niemann-Pick C1-like 1 рецептор поглощения холестерина

ПЭГ ИФН

пегилированный интерферон альфа

PI4KIIIα

фосфатидилинозитол-4-киназа IIIα

RdRp

РНК-зависимая РНК-полимераза

РТК

рецепторные тирозинкиназы

канал SRB1

мусорщик рецептор класса B тип I

SVR

устойчивый вирусологический ответ

ЛПОНП

липопротеины очень низкой плотности